重磅!Science在线发表circRNA研究论文

        8月10日，Science杂志在线发表了著名RNA研究学者，马克斯·德尔布吕克分子医学中心Nikolaus Rajewsky教授作为通讯作者的研究论文，介绍其发现的Cdr1as基因敲除小鼠模型中的重要发现[1]。

        文中作者通过构建Cdr1as基因敲除小鼠模型，进一步证明了Cdr1as与miR-7和miR-671的作用关系，电生理观察结果表明Cdr1as敲除后小鼠大脑神经突触间信号传递出现异常。这也是2010年后Science杂志首次正式报道circRNA相关的研究工作，意义非凡。大家看到这篇文章的时候一定也会思考这几个问题：作者通过什么技术构建的circRNA敲除模型的？敲除模型中的表型是怎样发现的？解释了什么科学问题？为什么可以发表到Sciecne杂志上？下面就让我们通过拜读这篇大作，一起学习吧。

1. Cdr1as基因敲除小鼠模型如何构建的？ 

        需要注意的是Cdr1as基因有几个特别的地方：

首先，Cdr1as基因是CDR1基因的互补链编码的，进行基因敲除的时候如何避免或者排除对CDR1基因的影响？

        其次，Cdr1as基因位于X染色体，存在体内X染色体失活的问题，该如何解决？

        最后，作者对Cdr1as的功能的解释是竞争性结合miR-7的，并且在Cdr1as序列中存在多达70多个miR-7的结合位点，因此必须实现Cdr1as的完全不表达。这与经典的蛋白编码基因敲除中只需要改变内源的ORF就可以实现基因敲除目的完全不同。

        基于上述的分析，想必大家一定可以认识到针对Cdr1as基因的敲除的难度了吧。那么，作者是怎样解决这些问题的呢？

        关于Cdr1as与CDR1基因的关系，首先要看看内源表达的情况，作者分析了24组链特异性测序（来自小鼠不同大脑组织）以及已报到的各种已发表的大脑中该位置各种测序的结果，均表明在大脑中，CDR1基因的mRNA几乎没有表达。这也就说明即使完整的敲掉所有的CDR1as覆盖序列，也不会存在另一链表达变化而造成的干扰。因此，上面提到的第一个问题也就不存在了。定位于X染色体的基因在体细胞中敲除可能会存在敲除不彻底的问题，但这个可以通过筛选实验而避免。后面的两个问题只需要通过设计完整删除CDR1as序列并通过有效的筛选鉴定即可获得，只是工作量相对于常规基因敲除实验，技术方面是可行的。

图1 内源性CDR1表达分析（来自[1]）

Cas-9打靶位点设计

        本文作者采取基于CRISPR-Cas9基因敲除技术进行基因敲除，总体设计方案是在基因组中编码Cdr1as基因的两端进行同步切除。gRNA设计依据在线工具：

CRISPR Design（http://crispr.mit.edu/）。

图2 CDR1as基因敲除基因设计与序列鉴定（来自[1]）

显微注射与杂交

        总体思路是基于体外转录分别获得Cas-9蛋白和gRNA的RNA分子，通过显微注射卵子，移植至假孕小鼠并获得成活的幼崽，然后根据基因型鉴定结果，通过杂交获得纯合的敲除克隆。

        文中作者通过显微注射获得了两个带突变信息的雌性小鼠幼崽，但两只小鼠的基因型均为杂合突变型，即它们的两条X染色体虽然均被有效打靶了，但不是完全一致的序列。通过回交，其中的一株获得了携带均一突变位点的雄性。然后再通过杂交，最终获得了纯合的携带单一有效敲除的小鼠克隆。

敲除效果验证

        除了测序鉴定基因型，作者还通过原位杂交，Northern等实验验证了所获得的敲除小鼠克隆的敲除效果。

图3 敲除小鼠鉴定（来自[1]，排列稍有改动）

2. Cdr1as基因敲除小鼠表型如何发现的？ 

体内Cdr1as表达状况

        利用CLIP-seq技术，作者证明了在小鼠大脑中miR-7和miR-647与Cdr1as通过AGO蛋白结合。基于这一实验，作者发现lncRNA Cyrano是CDR1as之外结合miR-7最多的RNA分子。基于荧光原位杂交实验，作者分析了小鼠大脑中CDR1as的表达分布，发现CDR1as主要在神经元中表达，胶质细胞中非常少。

图4 小鼠大脑中CDR1as表达情况（来自[1]）

Cdr1as-KO小鼠miR-7 和miR-671表达状况

        通过二代测序分别分析Cdr1as-KO小鼠的小脑，大脑皮层，海马和嗅球中miRNAs的表达情况，结果表明在Cdr1as-KO小鼠中miR-7的表达显著降低，Northern杂交，荧光原位杂交和QPCR实验均证实了这一变化。并且来自于不同基因座转录产生的miR-7a-5p和miR-7b-5p均有明显下降。深度测序的结果也显示，只有8种miRNAs在Cdr1as-KO小鼠中出现了明显的下调作用。作者还发现miR-7的下调是转录后的结果，因为不同miR-7转录前体分子的变化并不明显。

        与miR-7显著下调对应的是miR-671的显著上调，从转录组水平来看，miR-671是唯一上调的miRNA分子。miR-671的上调也是转录后水平的变化。

        除了大脑，作者还分析了其他组织中Cdr1as、miR-7 和miR-671表达情况，包括肺、骨骼肌、脾、心脏和脊髓。在正常脾脏中，Cdr1as几乎不表达而miR-7表达量非常高。除脊髓外，其他组织中Cdr1as敲除前后miR-7和miR-671的表达变化并不明显。而脊髓中Cdr1as敲除后miR-7表达明显下调。

图5 CDR1as敲除后miR-7和miR-671表达变化情况（来自[1]）

Cdr1as-KO小鼠下游基因的影响情况

        通过全转录组分析，作者发现CDR1as敲除后受miR-7调控的基因出现明显变化，包括Fos，Nr4a3，Irs2，Klf4及lncRNA Cyrano的表达受到明显影响。后续进行了包括QPCR，Western等实验验证。

图6 CDR1as敲除对miR-7下游调控基因影响显著（来自[1]）

Cdr1as-KO小鼠神经电生理表型

        正常的兴奋性神经元中往往高表达CDR1as，因此作者首先分析了CDR1as敲除对该类神经元突触的影响情况。作者发现CDR1as敲除后自发性囊泡释放的速度提高了两倍以上，但幅度并没有太大的变化。对于两次重复的刺激条件，突触反应也出现变化。这些表明CDR1as敲除部分改变了突触调控相关蛋白的表达水平，导致了突触囊泡释放和钙稳态的改变。对应于这些神经电生理变化，小鼠行为方面也出现了微弱的变化。总体而言CDR1as敲除与否，小鼠的生理行为并没有太大的改变，但在噪音刺激下，CDR1as敲除后小鼠反应相对于正常小鼠变得迟钝，有点类似于人类精神分裂症的表现。

图7 CDR1as敲除对小鼠神经电生理的影响（来自[1]）

        总之，关于CDR1as敲除小鼠表型分析的问题，作者首先基于CDR1as和靶分子miR-7，miR-671表达特征的分析，从转录组水平探索了分子机制，从神经电生理表型探索了CDR1as敲除对神经元生理行为的变化，并进一步分析了模型动物对噪声刺激的应答行为。从分子机制入手，进一步转向行为表型，最终解释了CDR1as敲除的表型问题。值得一提的是，从作者的描述来看，CDR1as敲除后小鼠的行为几乎没有太明显的变化，到最后能找出度噪音刺激的不同应答表现，这其实是挺有难度的工作。山人认为，作者所采取的将分子机制和神经电生理结果结合起来分析敲除后表型的思路很值得借鉴学习。 

3. 本文解决了什么科学问题？

        本文是作者在前期研究报道基础上的延伸，解决了CDR1as在模式生物中表型的问题。一方面进一步验证了体内CDR1as作为miRNA Sponge竞争性结合miR-7的现象，也回答了这一功能模型在体内如何发挥作用的问题。通过本文的研究，表明了CDR1as竞争性结合miR-7对兴奋性神经元的突触活动和神经电生理的影响方式，是一个重要的科学问题。

4. 关于本文为什么可以发表在Science杂志上的几点思考： 

        本文的工作从基因敲除模型中回到了CDR1as竞争性结合miR-7的生理机制和意义，对于CDR1as的功能研究以及circRNA功能研究都具有非常高的参考价值。本文为什么能够发表在Science杂志上，山人以为可能主要有以下两方面的原因：

（1）基因敲除模型，机制清晰。要回答某个基因的功能问题，基因敲除模型是最有力的证据之一。本文通过合理设计，构建了彻底敲除全长CDR1as的小鼠模型，也因为所对应的互补链上CDR1基因恰好不在大脑中表达，这一敲除模型便做到了单一因素敲除的效果，避免了其他因素带来的干扰。基于前期的研究，CDR1as可竞争性结合miR-7，并且受到miR-671的调控。在本文的模型中，只需要分别检测这些分子的表达情况及下游分子的变化，就可以形成非常完善的分子机制模型。实验结果也充分证明了这一机制的正确性。因此本文的敲除模型分子机制解释是非常清晰明确的。在基因敲除模型中找到清晰明确的分子机制大大提高了本文的科学价值，这是本文能够发表在Science杂志上的一个重要原因。

（2）回答了CDR1as竞争性结合miR-7的生理意义这一重要科学问题。哺乳动物存在巨量的circRNA，但它们的分子机制一直是制约circRNA研究的重要原因。CDR1as竞争性结合miR-7是目前最有说服力的miRNA sponge模型分子。CDR1as竞争性结合miR-7在体内是怎样发挥作用的这一重要科学问题还没有非常明确的证据。CDR1as敲除是回答这一问题的关键。本文的工作正是解决了这个科学问题。作者从转录组到神经电生理检测，再到行为学研究，打通了CDR1as竞争性结合miR-7的分子模型在动物生理行为表型关系方面的通道，有效回到了该功能模型的生理意义问题。当然本文的发现可能并不是该功能模型唯一对应的生理表型，但这一工作也为今后开展相关工作铺平了道路，因此具有重要的科学意义。

        最后，本文毫无疑问将是2017年度circRNA研究的重大进展之一。值得一提的是，Science是2010年以来三大基础研究顶级杂志（Nature，Cell和Science，NCS）中最后一个正式发表circRNA研究论文的杂志。本文的发表也充分说明circRNA正在渐渐被国际一流的学者所接受和重视。未来只要能够系统全面的解释circRNA分子功能和生理病理意义的研究工作都很有可能会受到国际同行的认可，并有希望陆续发表在NCS杂志上。期待未来有更多更有趣的circRNA研究工作发表出来。

参考文献：

1. Piwecka, M., et al., Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science, 2017.

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