近日，中国科学院动物研究所段恩奎/张莹研究组和周琪研究组，与美国 University of Nevada, Reno 的 Qi Chen 实验室以及德国 German Cancer Research Center 的 Frank Lyko 实验室合作，揭示了 RNA 甲基化转移酶 Dnmt2 在精子 RNA 介导的获得性代谢疾病跨代遗传中的重要作用。该研究成果以Dnmt2 mediates intergenerational transmission of paternally acquired metabolic disorders through sperm small non-coding RNAs为题，于2018年4月25日在 Nature Cell Biology 杂志在线发表。
精子介导的获得性表型跨代遗传是近年来的新兴研究热点，这个领域的兴起似乎把科学史上已被打入冷宫的“拉马克遗传”理论重新搬上了现代生物学的舞台。目前该领域的核心观点是配子可以利用DNA序列之外的表观遗传信息载体（DNA甲基化、组蛋白修饰，RNA 等）将获得性性状传递给下一代。尤其引人关注的是，近年来关于哺乳动物精子 RNA 在此过程中的作用为这个领域注入了新的活力，BioArt就曾深度报道过 RNA 可作为记忆载体将获得性性状跨代遗传的工作(Gapp, Nat Neuronsci , 2014; Rodgers, PNAS, 2015; Chen, Science, 2016; Sharma, Science, 2016; Chen, Nat Rev Genet, 2016 )。了解更多详情，可阅读段恩奎等人发表于 Nat Rev Genet 关于“获得性遗传”的重要综述。
‘I’m back’,says Lamarck’s giraffe.
在本项 Nat Cell Biol 工作中，合作团队在 Science 工作的基础上进一步发现，RNA 甲基化转移酶 Dnmt2 对塑造精子 RNA 的“编码指纹 (coding signature)”具有重要的作用。Dnmt2 缺失破坏了由精子 RNA 序列和 RNA 修饰共同组成的精子RNA “编码指纹”，使之不能将父代高脂诱导的获得性性状传递给子代。文章还发现 Dnmt2 介导的 RNA 修饰能够改变 tsRNA 的结构和功能，为研究精子 RNAs 的作用机制打开了新思路。也从 RNA 修饰的角度进一步强调了精子 RNA 携带的父代获得性表观遗传信息的复杂调控。该项工作近期被 CSHA 冷泉港亚洲会议（染色质、表观遗传学和转录）选中，由一作张云芳做会议报告，引起了同行的诸多关注和提问。
今年4月的CSHA 冷泉港亚洲会议，张云芳作报告
（摄影：廣進）
另外，据悉这项工作中关于小RNA 分析的部分用到了团队开发的一个新软件SPORTS1.0 (sRNA annotation pipeline optimizedfor rRNA- and tRNA- derived sRNAs)，对精子中的 tsRNA (tRNA-derived small RNA) 和 rsRNA (tRNA-derived small RNA) 的表达谱有了新的发现。SPORTS1.0已经以 preprint 方式上传在 bioRxiv，近期将在 Genomics, Proteomics & Bioinformatics 杂志正式发表。
一个卧底在DNA甲基化酶家族中的RNA甲基化酶
神秘的Dnmt2
（友情提示）本文信息量较大，小编大概数了一下，文中提及的诺奖获得者、美国科学院院士、英国皇家院士、HHMI研究员、中国科学院院士数量加起来就有十几个，还有不少院士候选人以及中国著名杂志editors；以及一个让小编作为一枚PhD为之动容的精彩励志故事。大家可以当做彩蛋找找哦 :)
撰文 | 昼夜思索
关于 Dnmt2 基因在 DNA甲基化，RNA甲基化以及表观遗传调控方面的功能研究和发现经历了不少曲折，延伸出不少意外的有趣发现以及新的研究方向。在过去 20多年中，对 Dnmt2 的研究工作经历了一个困惑期（认为它是 DNA甲基化酶）、顿悟期（揭示它对 tRNA 特定位点甲基化的功能以及对 tsRNA 生成的影响）、以及目前正在进行的扩展期（对细胞/个体 stress 的调控，以及在 RNA 介导的获得性性状跨代遗传中的作用）。
鉴于 Dnmt2 所属的其他 Dnmt 家族成员（DNA (cytosine-5)-methyltransferase）在 DNA甲基化及表观遗传领域的重要作用，我们也在这里简略介绍一下其他 Dnmt 家族成员的研究简史，其中涉及哥伦比亚大学的 Timothy H. Bestor 和 MIT 的 Rudolf Jaenisch 等著名实验室和他们的嫡系实验室，以及一些相关领域做出杰出贡献的华人科学家实验室。
早在上世纪80年代，Jaenisch 实验室就发现经甲基化 (m5C) 的 DNA转染细胞后无法转录表达，而去除 m5C 后则可以恢复表达，从而提出 DNA甲基化可能调节真核生物基因转录的观点 (PNAS, 1981)【1】。 Bestor 实验室是研究 DNA甲基化酶的先驱，克隆了真核生物的第一个 DNA甲基化酶 (PNAS, 1983)【2】，后来被命名为 DNMT1 (DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1)。
1992年， Bestor 和 Jaenisch 实验室合作 (一作者是华人科学家 En Li)，在小鼠中敲除 DNMT1 基因后发现 Dnmt1 缺失导致 DNA甲基化水平大量降低到正常水平的~30%，并导致胚胎期死亡 (embryonic lethal) (Cell, 1992)【3】。随后 Bestor 实验室证明 DNMT1 缺失导致转座子 (transposon) 大量激活，进一步证明了 DNA甲基化抑制转座子表达这一结论（Nat Genet, 1998)【4】。目前认为 Dnmt1 的主要功能是对 DNA甲基化的维持 (maintenance) 起关键作用。
Jaenisch 实验室通过利用 Dnmt1 敲除鼠也进一步证明了印记基因 (gene imprinting) 现象的本质是 DNA甲基化，一作者也是华人科学家 En Li (Nature, 1993)【5】。
注：Gene imprinting 现象是 Azim Surani (Nature, 1984)【6】和 Davor Solter (Cell, 1984)【7】发现的，随后 Surani 实验室的博士后 Wolf Reik（现在也是著名大咖）通过分析随机插入的 transgene 片段的 DNA甲基化模式后，推测 gene imprinting 的本质是通过 DNA甲基化起作用 (Nature, 1987)【8】。值得一提的是，时隔30年后，著名华人科学家 Yi Zhang 实验室最近又发现了不依赖于 DNA甲基化，而依赖于母源 H3K27me3 的 gene imprinting 方式 (Nature, 2017)【9】。
另外，Jaenisch 实验室通过 DNMT1 敲除模型还证明了 DNA 甲基化是控制 X chromosome inactivation（雌性两条X染色体的其中之一失去活性的现象）的机理 (Gene Dev, 1995; Gene Dev, 1996)【10,11】。
Dnmt1 敲除后仍然有部分 DNA甲基化存在的现象也提示还有其他的 DNA甲基化酶。随后当时在哈佛大学的 En Li 实验室（现为上海诺华制药 (NIBR) 的head）证明 Dnmt3a 和 Dnmt3b 对小鼠胚胎的重新 DNA甲基化 (De Novo DNA Methylation) 具有重要作用，敲除鼠表型也是胚胎期死亡 (Cell, 1999)【12】。
2001年，Bestor实验室发现另一个 DNMT 相关家族成员，Dnmt3L， 也参与 DNA重新甲基化，并发现敲除鼠中母源印记基因的甲基化丢失 (Science, 2001)【13】（徐国良老师当时在 Bestor 实验室，也参与了这项工作）；以及 Dnmt3L 在精子发生过程中通过 De novo 甲基化对 transposon 的抑制有重要作用 (Nature, 2004) 【14】。
由于 Dnmt3L 不具备甲基化催化活性的结构域，顾推测其可能作为其他 de novo 甲基化酶的 co-factor 起作用，后来在美国的华人科学家 Xiaodong Cheng 实验室和德国的 Albert Jeltsch 实验室合作共同证明 Dnmt3L 和 Dnmt3a 通过形成复合体一起介导 De novo 甲基化 (Nature, 2007)【15】。11年之后，加州大学河滨分校的华人科学家Jikui Song 实验室进一步获得了高分辨率的 DNMT3a-DNMT3L-DNA 复合体结构，在分子水平加深了对 DNA de nove 甲基化过程的理解 (Nature, 2018)【16】。
同在2007年，Bestor 实验室与 Xiaodong Cheng 实验室的另一项合作研究表明 DNMT3L 可以一方面选择性地与组蛋白甲基化 H3K4 结合，同时可以与 Dnmt3形成复合体 (Nature, 2007) 【17】。这个里程碑式的研究第一次把组蛋白甲基化marker 与 DNA de novo甲基化联系了起来，也在一定程度上解释了 DNA 的 de novo 甲基化如何在组蛋白修饰的指导下在 genome上选择特异的位置（组蛋白修饰领域的大牛 David Allis 也参与了这项研究）。
值得一提的是，Bestor 的学生 Déborah Bourc'his （Dnmt3L 两项重要工作的一作者 (Science, 2001; Nature, 2004)【13,14】在成立自己的实验室之后，最近又在小鼠雄性生殖细胞中发现了 Dnmt3c（之前认为是一个假基因）介导的 DNA甲基化对抑制 young transposon 的活性至关重要，敲除后导致雄性不育 (Science, 2016)【18】。
讲了一大堆，以上的研究都是 Dnmt 家族成员对 DNA甲基化研究的故事，现在我们终于来讲 DNMT2 这个 Dnmt 家族成员中的奇葩了。
在1998年，Bestor 实验室 (Hum Mol Genet, 1998)【19】和 En Li 实验室 (Nucleic Acids Res, 1998)【20】都克隆到了另一个 Dnmt 家族成员 Dnmt2。Dnmt2 从序列上看具有 DNA甲基化的催化结构域（图1），并且 Dnmt2在进化上高度保守，从酵母到人类均有保守的表达（线虫除外，线虫没有任何 Dnmt基因）。但是 En li 实验室发现 Dnmt2 在细胞水平不具有 DNA甲基化功能 (Nucleic Acids Res, 1998)【20】。随后 Bestor 实验室构建了 Dnmt2敲除鼠，继续对其进行功能研究。
图1. DNMT家族成员的分子结构域 (Nat Rev Genet, 2018)【21】
当时 Bestor 实验室负责这个课题的博士生是 Mary Grace Goll，当她拿到这个 DNMT2 敲除鼠后，发现小鼠好像活得很好；而且 DNMT2 的蛋白定位于细胞质而不是细胞核，同时也检测不到明显的 DNA甲基化水平的变化……实在是郁闷。但是据说 Mary 是一个好学生，做事情非常严谨，实验技术也非常扎实，她也不相信这么重要一个基因怎么会就没有 function 呢？于是她非常认真地从小鼠各个方面的表型以及 DNA甲基化层面（其研究延伸到了 DNMT2敲除的果蝇，以及 DNMT2敲除的拟南芥）去寻找 DNMT2敲除的表型，一做就是7年……直到 2005年的时候，她终于打算放弃了，打算写一个充满了 DNMT2 阴性结果的博士论文后毕业走人，Bestor 也同意了。然而在写论文的时候，她突发奇想了一下：“既然我已经证明了 Dnmt2 不能甲基化 DNA，干脆我把 RNA 也做一下，顺便证明 DNMT2 也不能甲基化 RNA 吧，这样把 DNMT2 拍死算了，论文也完整一些……”于是她就真去做了一把实验，结果这一做把她吓着了，怎么 Dnmt2 敲除还真看到 RNA 的 m5C 变化了！？由于做了 7年已经习惯了拿阴性结果，一下子看到阳性结果还不敢相信……于是她把手上各种能够用到的 DNMT2 敲除的细胞，组织，物种，都做了一次，发现这个结果是真的……于是她找到了 Bestor 说：“I finally figure out what DNMT2 can do……” 在后面的 5个月里，Mary 进一步把 DNMT2 对 RNA 的甲基化功能定位到了 tRNA-asp 上 38 位的 Cytosine (C38), 并证明在小鼠，果蝇，拟南芥中的 DNMT2 都是这个保守的功能。另外还证明 DNMT2 对这个 tRNA C38 位点的甲基化还需要依赖于 tRNA 的特殊结构构象（这种 tRNA构象的形成依赖于tRNA 上其他丰富的修饰参与），因为纯化出来的 DNMT2 可以给来自 DNMT2敲除动物/植物的 tRNA-asp 在 C38 加上一个 m5C， 但是不能给体外直接转录出的 tRNA-asp（这种 tRNA 上面没有其他修饰) 加上 m5C。这些结果于 2005年 10月投到Science，2005年 12月接收(Science, 2006)【22】(图2)。至此，这个里程碑式的工作终于让科学界对 DNMT2 的功能有了一个靠谱的认识。（Mary Grace Goll 目前在University of Geogia 当 PI，她似乎没有继续从事 Dnmt2 相关的工作。）
注：此部分故事由笔者根据当年在 Bestors 实验室的博士后 Shau-Ping Lin口述转述。Shau-Ping Lin 在剑桥大学 Anne C. Ferguson-Smith 实验室拿到 PhD，现在台湾任 PI。Anne C. Ferguson-Smith 是 Azim Surani 的学生，研究 imprinting gene 的先驱之一（Igf2r, Igf2 和 H19 几个最初发现的小鼠的 imprinting gene 均在 1991年被报道(Nature【23】, Cell【24】, Nature【25】, Nature【26】）。
图2. DNMT2 将 tRNA (Asp, Gly, Val) C38 位点的 C 催化为 m5C (Nat Rev Genet, 2018)【21】
DNMT2 甲基化 tRNA 的功能发现之后，其他一直在相关领域活跃的科学家也恍然大悟，也迅速跟进，其中 Albert Jeltsch 实验室在 2008年证明 human DNMT2 也具有催化 tRNA-asp C38 的类似功能，并且通过大量的 DNMT2 突变实验证明 DNMT2 对 tRNA 的甲基化所需要的结构域于其他 Dnmt家族成员催化 DNA甲基化用到的结构域的很像，却与其他 RNA甲基化酶非常不同 (RNA, 2008)【27】。（这也进一步提示 DNMT2 是个奇葩的东西~）
另外，之前在 Jaenisch 实验室从事 DNMT 相关工作的博士后 Frank lyko，也在这个领域迅速跟进并作出了重要贡献。（Frank Lyko 在 Jaenisch 实验室曾在果蝇中检测 DNA甲基化，发现其含量非常低 (Nature, 2000)【28】。如果给果蝇过表达 DNMT1 和 DNMT3，果蝇 DNA 出现过量的甲基化，影响果蝇存活 (Nat Genet, 1999)【29】。（注：果蝇基因组中只有 DNMT2 这一个 Dnmt 家族成员）。Frank lyko 在德国有了自己的实验室以后，在 2009年建立了一个 RNA m5C bisulfite sequencing 的检测方法 (Nucleic Acids Res, 2009)【30】，这个方法大大促进了高通量检测 tRNA 上 m5C 的检测效率，并且能够定位 m5C 的位点。通过这个方法，Lyko 实验室在 2010年进一步通过对比 DNMT2 野生型与敲除型果蝇后，发现 DNMT2 还能对除了 tRNA-asp 之外的其他 tRNA (tRNA-Glu, tRNA-Gly) 的 C38 进行 m5C 的修饰，并且证明 tRNA在 DNMT2 缺失进而丢失 C38 的 m5C 情况下，容易在 stress 情况下断裂，进而生成过量的 tRNA fragment（目前学界正在建议将 tRNA fragment 改名为 tsRNA (tRNA-dervided small RNA) (Gene Dev, 2010)【31】。这个机理在小鼠中保守存在 (Nat Struct Mol Cell Biol, 2012)【32】。Dnmt2 缺失导致 tRNA 断裂的增加以及 tsRNA 的堆积会对果蝇在应激情况下产生表型，导致果蝇生存力下降 (Gene Dev, 2010)【31】（图3）；Dnmt2 缺失在小鼠虽无明显表型 (Nat Struct Mol Cell Biol, 2012)【32】，但细致检查后发现对新生小鼠软骨骨化和造血有一定影响 (EMBO J, 2015)【31】。并且 Lyko 实验室还证明 Dnmt2 缺失导致的 tRNA-C38 甲基化丢失会导致 tRNA 对于其携带氨基酸的准确性降低（无法精确区分 Asp 和 Glu ） (EMBO J, 2015)【33】。
图3. tRNA 缺失 DNMT2 介导的 C38 位 m5C 甲基化之后容易被切割产生tsRNA (Trends Mol Med, 2016) 【34】
值得一提的是，Frank Lyko 实验室在 2013年和 Wolf Reik, Gregory Hannon 两位大咖合作，在 PNAS 发了一篇论文，在果蝇、Schistosoma mansoni（曼氏裂体吸虫，一种寄生虫）（这两个物种的基因组中只有 DNMT2 这一个 Dnmt 家族成员），以及基因改造后只表达 DNMT2 的小鼠胚胎干细胞（敲除Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b）这几个 Dnmt2-only 体系中，通过单碱基精度的 whole-genome bisulfite sequencing 对 DNMT2 在 DNA甲基化方面的作用进行了几乎全面的否定（这包括对他自己当年博后期间发的文章 (Nature, 2000)【28】，以及 Albert Jeltsch 实验室的文章 (EMBO J, 2000)【35】进行了否定），认为过去检测到的非常低剂量的 DNA甲基化也许都来自其他物种 DNA 的污染 (PNAS, 2013)【36】。Frank Lyko 发表这篇文章是勇气可嘉的，这也推动了领域向正确的方向发展。
在 DNMT2 对 tRNA 修饰以及生物功能逐渐揭示的同时，另一个与其看似相去甚远的领域也在冉冉升起，并最终开始与 DNMT2 的相关研究开始汇合。这个领域就是我们要讲到的 epigenetic inheritance（表观遗传信息的跨代遗传现象）。由于在受精卵时期和胚胎发育的 PGC（Primordial germ cell，原始生殖细胞）时期，基因组会经历两次 epigenetic reprogramming，清除大部分的 DNA甲基化以及染色质上的修饰 (Science, 2010)【37】，所以过去学界一般认为上一代获得的表观遗传信息无法传递到下一代。然而近年来的研究越来越多的表明确实有一些上一代的获得性性状能够传递给下一代（精神紧张，饮食导致的代谢疾病等），这激发了科学家很大的兴趣，一部分学者认为有些DNA甲基化或者染色质上的修饰可以逃逸 epigenetic reprogramming，而另一部分则认为也许携带这些获得性性状的分子信息的储存并不是依赖于 DNA 及其相关修饰（比如被 RNA 所携带）(Nat Rev Genet, 2016)【38】。 Minoo Rassoulzadegan 实验室是在哺乳动物中研究精子 RNA 介导表观遗传现象的先驱，她们于 2006年发现 kit敲除鼠的杂合子小鼠会出现一种“白尾巴”的表型，同时杂合子雄鼠的和精子中会出现一堆异常表达的 Kit mRNA 片段，如果把这些奇怪的 kit RNA 片段注射到正常的受精卵里，会导致后代的小鼠（基因型为野生型）也出现类似于 kit杂合子的“白尾巴”表型(Nature, 2006)【39】，这提示 RNA 也许可以作为一种表观遗传信息载体介导后代的表型。在2013年，Lyko 实验室和 Minoo 实验室合作，发表了一篇有趣的论文，他们报道说 DNMT2 的缺失可以阻断这种由精子 RNA 介导的非孟德尔遗传现象——如果同样把奇怪的 kit RNA 注射到 DNMT2 敲除的受精卵里，出生的后代中这种“白尾巴”表型就消失了(Plos Genet, 2013)【40】。Lyko 和 Minoo 观察到这个奇怪的现象后，试图从 RNA甲基化的角度来解释，他们报道 DNMT2 能够在一定程度上影响 kit mRNA 某些 C位点上的甲基化，但因为 DNMT2 对于 mRNA 的甲基化活性目前没有确切的证据，这个解释的可靠性尚有争议。
在 Lyko 和 Minoo 投稿这篇 Plos Genet 的时候（2012年10月）， Qi Chen（现在内华达大学任 PI）实验室的一项研究发现，小鼠成熟精子中含有大量的 tsRNA（富集在 30-40nt）（图4）（含量远高于 miRNA 和 piRNA，这也是第一次在哺乳动物生理情况下发现大量的 tsRNA 的富集，随后段恩奎/Qi Chen 团队还进一步和山东大学陈子江实验室以及云南灵长类中心的季维智实验室合作，发现 tsRNA 在包括猴子和人的各种脊椎动物血清中也大量保守存在，并在疾病状态下发生敏感变化 (J Mol Cell Biol【41】）, 然而这些 tsRNA 的具体功能尚未知晓 (Cell Res, 2012)【42】（据说当时这篇文章在对 tsRNA 功能尚不清楚的情况下能得到快速发表，得力于 Cell Research 李党生和裴钢的大力支持。据说当时党生看了这个发现之后说：“赶紧投过来……”）。文章发表之后，Cell Research 邀请 Minoo 对这个工作进行 Highlight 点评, 文中推测精子中这些大量的 tsRNA 也许和 RNA介导的 epigenetic inheritance 有关 (Cell Res, 2013)【43】。、段恩奎，翟琦巍和 Qi Chen 实验室），在一个通过高脂饮食诱导的小鼠跨代遗传模型中证实了这个猜测：通过给正常受精卵注射来自于高脂小鼠的精子 RNA（总 RNA 或 30-40nt 区段的 RNA），发现后代小鼠能够继承父代小鼠的获得性代谢紊乱，这证明小鼠精子中的 tsRNA 在介导父代获得性性状（代谢异常）的跨代遗传中具有重要作用；并且发现高脂饮食能够诱导精子 RNA 中 30-40nt 区段的 RNA修饰（m5C，m2G升高）发生明显改变，提示 RNA修饰也参与了跨代信息的传递 (Science, 2016)【44】。同时，马萨诸塞大学医学院的 Oliver Rando 实验室也与 Craig C. Mello 等实验室合作，也发表了一篇背靠背的 Science 文章报道在低蛋白饮食的小鼠模型中精子 tsRNA 成分也发生了变化，以及给受精卵注射tsRNA可以改变早期胚胎基因的表达 (Science, 2016)【45】。（延伸阅读：BioArt 之前对此做过深度报道：【新增BioArt按】你遗传给后代的比你想象的要多——表观遗传的祖辈“原罪”）
图4. 小鼠精子发生到成熟过程中小 RNA 的动态变化（Nat Rev Genet, 2016）【38】
有意思的是，Lyko 和 Minoo的工作 (PloS genet, 2013)【40】 (Science, 2016)【44】都尝试了注射化学合成的不带修饰的小RNA，但是都发现不带有修饰的 RNA 无法诱导后代表现。这提示了小RNA 上携带的 RNA修饰对携带跨代遗传信息是非常重要的。随后两个团队分别在两篇各自的 Nat Rev Genet 综述中提到下一步研究精子 RNA 的修饰是理解精子跨代遗传的一个重要方向 (Nat Rev Genet, 2016)【38】，(Nat Rev Genet, 2018)【21】。DNMT2 可能通过 tRNA 修饰，以及对精子 tsRNA biogenesis 的调控，在 epigenetic inheritance 中起到关键作用。
2018年， Frank Lyko, Qi Chen 实验室再度合作，将精子 RNA/tsRNA 跨代遗传方面的研究和 Dnmt2 功能进一步联系了起来。通过小鼠高脂肪模型，合作团队发现在高脂肪饮食下，野生型小鼠的精子 RNA（总RNA，或者 30-40nt 区段的 RNA）能够将父代的获得性代谢表型传递给子代；但是同样在高脂肪饮食下，Dnmt2 敲除鼠的精子 RNA 则不能将父代的代谢表型传递给子代。这说明在高脂饮食情况下，Dnmt2 对塑造精子 RNA 所携带的父代获得性状的“指纹编码 (coding signature)”具有重要的作用 (Nat Cell Biol, 2018)【46】。而这种精子 RNA 的“指纹编码”似乎是由精子 RNA序列和 RNA修饰共同组成（图5），因为 Dnmt2 介导的 RNA修饰能够明显地改变精子 tsRNA 的结构和功能；并且 Dnmt2 的缺失也直接导致精子 tsRNA 的 m5C 修饰以及表达谱发生变化，以及精子中 rsRNA (rRNA-derived small RNA) 的表达变化（精子中的 rsRNA (J Mol Cell Biol, 2017)【47】）(Nat Cell Biol, 2018)【46】。这项研究从 Dnmt2和RNA修饰的角度进一步强调了精子RNA携带父代获得性信息的复杂调控。
图5. DNMT2 对饮食诱导形成的精子 RNA “指纹编码”至关重要 (Nat Cell Biol, 2018)【46】
最后加一些花絮：
参考文献
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