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详解争议论文:谢灿、张生家分别做了什么?“抢发”是否存在?

赛先生2018-12-11 10:03:46

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整理 马宏 吴兰


2015年9月,北大清华的两位科学家陷入了前所未有的争议漩涡中,清华大学学者张生家在Science Bulletin发表了一篇关于磁遗传学的论文,被北大学者谢灿控为“抢发”,掀起中国学术界的一个难解谜题。两所大学展开调查,清华大学随后将张生家解雇。


11月,谢灿的论文终于公开发表于Nature Materials,科学界与公众终于获得与这场风波有关的全部具体学术信息。本文对两位科学家的论文做了详细注解,通过这些注解,读者可以一览两位科学家各自的工作,也能对“论文抢发之说”有更深入的认识,形成自己的观点。


我们除了关注这个争议事件本身,还应该关注该事件的长远影响:在科研合作越来越来普遍的今天,科学家如何规范合作方式,避免这类事件的发生?当然,争议不应该掩盖两位科学家的科研成果:本文亦是对“磁遗传学”领域一系列重要发现的详细介绍。


先来看谢灿的研究


A magnetic protein biocompass(一种磁性生物指南针)

Siying Qin,Hang Yin,Celi Yang,Yunfeng Dou,Zhongmin Liu,Peng Zhang,He Yu,Yulong Huang,Jing Feng,Junfeng Hao,Jia Hao,Lizong Deng,Xiyun Yan,Xiaoli Dong,Zhongxian Zhao,Taijiao Jiang,Hong-Wei Wang,Shu-Jin Luo& Can Xie,Nature Materials (2015)

Received 04 August 2015, Accepted 21 October 2015, Published online 16 November 2015


关键词MagR(即Drosophila CG8198),Cry隐花色素,Cryptochromes ,是一种感光蛋白),磁感受器复合体(MagR与Cry构成的复合蛋白,具有内在磁性)


◆ 论文摘要“动物可以感知地球磁场”这一观点曾经饱受嘲弄,但是现在这一观点早已获得充分证实。然而这种磁感应现象背后的生物学原理我们依然不得而知。经过理论推导、全基因组筛选,并且通过细胞、生物化学、结构和生物物理学的鉴定,本文报道了一种可能的磁受体(Drosophila CG8198,在此称为MagR)和一种具有磁感应功能的多聚棒状蛋白质复合体。磁感应复合体由两部分组成:经鉴定得到的可能的磁受体,以及已知的、与磁感受相关的隐花色素(Cry)。这一磁感应复合体同时具有铁基系统和隐花色素的特性,并且能在包括地球磁场在内的磁场中自发排列。这样的蛋白质复合体也许是动物磁感应的基石,同时也会在诸多领域中激发出广泛的应用。


论文图解


谢灿的论文主要提出、解答了以下问题:


一、MagR是如何被发现的?MagR与Cry/MagR的物理结构有何特点?



图a:筛选流程

谢灿团队从果蝇入手,筛选生物体内潜在的磁感受蛋白。他们认为,果蝇中的磁感受蛋白应该具有以下特点:

1)含有铁元素,或者可以与铁结合

2)在头部表达

3)不存在于细胞膜上

他们以此为依据,从果蝇基因组的12 536个编码蛋白的基因中,进行了3轮计算机筛选,随后又进行了1轮理论筛选,1轮实验筛选与验证,最终成功鉴定出MagR蛋白。



图b:实验筛选原理:设计体外实验,筛选能与Cry蛋白相结合的候选MagR蛋白。



图c:黑腹果蝇、黑脉金斑蝶、原鸽,以及人体内均存在Cry/MagR复合体。左图为上述4种生物体内的Cry/MagR共纯化电泳图。




图d:MagR在生物体内有两种主要的存在形式。其中一种是MagR单体,另一种是MagR多聚体



图e:MagR多聚体可能呈双螺旋棒状结构(如右侧的示意图)。图为负染色法对原鸽的MagR多聚体进行染色后在电镜下观察到的MagR多聚体结构。



图f:Cry/MagR磁感受器复合体有两种主要存在形式。其中,大质量的聚合体可能是由磁感受器互相吸引形成的。





图g-k:根据观测结果,推导出Cry和MagR的结合方式。图为原鸽的Cry/MagR复合体经负染色后的电镜结构及其示意图(黄色部分为MagR蛋白,青色为Cry蛋白)


二、Cry和MagR是如何构成磁感受器的?这样的结构为什么会具有磁性?



图a、b:20个MagR分子组成的双螺旋棒状结构的侧视图与顶视图。蓝色方框中为一个MagR分子,黑色方框中则包含4个MagR分子,这4个分子组成了一个碟形单元,来自4个分子的铁硫簇聚集在碟形中央,形成一个铁环。


图c,d:Cry/MagR磁感受复合体的完整结构示意图(c为侧视图,d为顶视图)。10个青色的Cry分子围绕在黄色的MagR分子组成的核心周围。电子可以在Cry中的FAD与MagR中的铁硫簇之间移动。



图e:Cry蛋白与MagR蛋白连接方式的示意图。为了突出MagR的双螺旋特性,MagR被为黄色和橙色,而5个Cry蛋白则被标为青色。红色、蓝色和灰色的部分是其他Cry蛋白与MagR蛋白的接触点。下方4幅电镜图显示出Cry与MagR最典型的4种连接形态。


四、 原鸽视网膜的各层上是否存在Cry与MagR?



图a-l:Cry和MagR共同存在于原鸽视网膜上的某些细胞中,提示视网膜细胞中确实有Cry/MagR磁感受器存在。



图m、n:视网膜上主要细胞种类的示意图。


五、原鸽体内的磁感受器复合体是否具有磁性?



图a:地磁场中(0.4G, 0.04 mT)的clCry4/clMagR磁感受器复合体(框中)呈现出有规律的的排布方式。这些被分离出来的棒状颗粒按照与地磁场平行(红色)、垂直(蓝色)和其他角度(黄色)的方式排列。



图b:被分离出的磁感受颗粒分别被置于地磁场(0.4G, 0.04 mT)和增强型外磁场(10G, 1 mT)下的方向分布比例。增强型外磁场的施加方向与地磁场垂直。


图c:使用铁珠帮助收集原鸽体内的clMagR和clCry4/clMagR(cl意为原鸽)复合体,可以显著增加其富集度。


图d:磁感受蛋白晶体具有强烈的内在磁极,并且会随着外部磁场的旋转而旋转。


图e:clCry4/clMagR磁感受复合体的磁特性分析显示出磁滞环的存在,进而可以推断出clCry4/clMagR具有亚铁磁性。


图f,与clCry4/clMagR做对比的是人源磁性铁蛋白纳米颗粒,和前者不同的线性图说明此颗粒不具有亚铁磁性。


五、总结


谢灿团队提出的动物用来感受磁场和导航的“生物罗盘”模型,该模型具有光依赖性,核心是一个具有内在磁性、由蛋白质磁复合体构成的磁感受器Cry/MagR复合体。



图a:该磁感受器在纳米尺度上的示意图。复合体的中心是一个棒状的蛋白多聚结构,该结构由线性聚合的磁感受受体(Magnetoreceptor,简称MagR)组成,MagR中含有铁硫簇;棒状结构的外部缠绕着隐花色素(Cryptochromes ,简称Cry,是一种感光蛋白)。图b:a的截面图。此结构说明,受到光刺激时,电子可能会从Cry中的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD,Cry中的一种生色团)转移至MagR中的铁硫簇。




图c. 使用Cry/MagR复合体来进行地磁导航的动物,能够从地球磁场中获取地磁极性、地磁强度和磁倾角等信息。Cry/MagR复合体的内禀磁矩或许形成了一个极性罗盘,进而可以感知地球磁场的方向信息。此次研究中用到了原鸽和黑脉金斑蝶中的MagR蛋白以及Cry/MagR复合体,这说明生物罗盘模型具有演化上的保守性。


***

谢灿的研究到此结束,下面是张生家论文的核心内容。


Magnetogenetics: remote non-invasive magnetic activation of neuronal activity with a magnetoreceptor

磁遗传学:利用一种磁受体,实现对神经活动远程、非侵入性的磁激活

Long X, Ye J, Zhao D, et al., Science Bulletin, 1-13

Received: 9 September 2015 / Accepted: 11 September 2015/Published online: 14 September 2015


关键词:铁硫簇结合蛋白1Iscal1,细菌中的一种铁硫蛋白,即作者在论文中提到MAR蛋白,与谢灿在果蝇中筛选到的、在黑脉金斑蝶、原鸽与人中找到与Cry结合MagR蛋白同源),磁遗传学


论文摘要现在的神经调节技术,如光遗传学和深部脑刺激,正在改变基础和转化神经科学。然而这两种神经调节技术却具有侵入性,需要实施手术来植入光纤或是接入电极才能进行。有鉴于此,我们发明了一种非侵入性的磁遗传学方法,此方法将远程磁刺激和对一种磁受体的遗传靶向相结合。神经元的非侵入性激活是通过一种外源性磁受体——铁硫簇结合蛋白1(Isca1)——的神经表达而实现的。对表达这一磁受体的HEK-293细胞以及体外培养的海马神经元施加外部磁场后,超敏的钙离子荧光指示剂GCaMP6提示了可逆与可重复的膜去极化,以及钙离子流动。


另外,神经活动的磁遗传控制也可能受到磁场方向的影响,并因此对外部磁场产生开/关反应(on/off-response)。通过这一磁受体,远处的磁场可反复使神经元去极化,并引发连续的动作电位,这些电活动均能由全细胞膜片钳记录到。对myo-3肌肉细胞或mec-4神经元特异性表达该磁受体的转基因秀丽隐杆线虫施加外部磁场,可诱发其收缩或舒张,这提示,肌肉细胞和触觉接收神经元可以被一种依赖磁场的方式激活。相较于光遗传学,磁遗传学的优势在于它独特的非侵入性、高穿透性、能够给予长期且持续的剂量、不受限制的可操作性,空间一致性和更高的安全性。正如经过10年发展和改进的光遗传技术一样,经过不断改进和成熟,磁遗传会让神经调节技术发生翻天覆地的变化,并引在基础和转化神经学以及其他生物学领域得到广泛应用。


论文图解


张生家通过研究,主要做出了以下发现:


一、带有外源MAR的HEK-293细胞可以对磁场做出反应,并导致细胞膜的去极化。


张生家团队利用远程磁刺激,启动了带有MAR的细胞的磁遗传效应。


图a、b:电磁线圈可以成功使带有磁感受蛋白MAR的细胞膜去极化。研究者向HEK-293中转入了MAR和指示钙离子跨膜运动的荧光蛋白GCaMP6s。细胞发出的荧光的强度,可以表示钙离子跨细胞膜流动的程度(即细胞膜去极化的程度)。由图可见,施加磁场后,HEK-293的细胞膜发生了去极化。



图c、d:磁体同样可以使细胞膜去极化。



图e:对HEK-293细胞的荧光水平(即钙离子的跨膜流动)进行定量描述。磁激活(蓝色方条)后,带有GCaMP6s和MAR细胞表现出增强的荧光水平,而带有GCaMP6s、没有MAR的对照组则毫无变化。



图f:对能够诱发细胞钙离子跨膜运动的最小磁场强度进行定量描述。


二、在MAR蛋白的介导下,大鼠海马细胞的活动可以由磁场控制。


图a:实验示意图:用电磁线圈对体外培养的大鼠海马细胞(其中包括转入了外源MAR和GCaMP6s的海马细胞)施加磁场,并进行钙成像。



图b:共聚焦显微成像结果,显示GCaMP6s和MAR在细胞中的定位有重叠


图c:对大鼠海马细胞的荧光水平(即钙离子的跨膜流动)进行定量描述。由图可见,施加外部磁场后,只有转入MAR的实验组(橙色)的荧光水平出现变化,而没有MAR的对照组(黑色)没有反应。这组实验说明,MAR蛋白可以作为细胞对磁场的感受器,据此,研究者可以实现对神经元的磁控制。


图d-e:膜电位变化的潜伏期、持续时间、变化峰值。


三、在MAR的介导下,外部磁场可以对神经元活动进行磁方向的选择性控制。开启或关闭外部磁场时,神经元活动表现出开/关反应。



图a:实验示意图:A和B线圈负责产生X方向的磁场,而C与D线圈则产生Y方向的磁场。



图b:3个不同的神经元在不同磁场方向下的发出的荧光强度。#1神经元只对X方向的磁场产生明显反应,#2神经元只对Y方向的磁场产生反应,3#神经元对X和Y方向的磁场均做出了反应。图c、d描述了开启或关闭外部磁场时,不同的神经元表现出的不同开/关反应。#1神经元在磁场开启时产生了明显的钙离子跨膜流动,对磁场关闭则毫无反应。#2神经元则与#1完全相反。#3神经元对于磁场的开启和关闭都做出了反应。


四、在MAR蛋白的介导下,磁场可以诱发神经元的峰电活动。



图a:全细胞膜片钳记录实验模式图,磁刺激源是一对手持式磁铁。



图b:神经元的共聚焦成像图。这是一个同时表达MAR和mCherry(一种红色荧光蛋白) 的神经元。



图c:磁刺激能够导致细胞膜电位的变化,图为全细胞膜片钳记录结果图。实验显示,3个神经元样本在被施加磁场后均出现了膜去极化反应,并且提高了放电频率。图d:开启或关闭外部磁场时,MAR蛋白可以介导细胞的开/关放电效应。电压记录显示,3个神经元对磁场的开启与关闭表现出截然不同的放电模式。#4神经元只对磁场的开启做出反应,#5神经元只对磁场关闭做出反应,#6则对磁场的开启与关闭均做出反应。



图e:对磁场诱发的动作电位进行定量描述。上图比较了表达/不表达MAR蛋白的细胞中磁场诱发的动作电位的数量,下图比较了动作电位的起始潜伏期与平均持续时间。


五、在MAR蛋白的介导下,磁场可以控制秀丽隐杆线虫。



图a:体内含有MAR蛋白的秀丽隐杆线虫,图为线虫体内的MAR蛋白在落射荧光显微镜下的影像。



图b:当外部磁场开启时,体内含有MAR蛋白的线虫的身体肌肉会同步收缩。可以看到,磁场开启前,线虫身体处于放松状态。磁场开启后,线虫身体的长度发生了明显改变。



图c:对照组(黑色)和实验组(橙色)线虫的身体长度与磁场状态的关系。实验组的线虫在磁场开启后收缩到原长度的94%,而野生线虫则没有反应。



图d. MAR蛋白在线虫的PLM神经元(一种感受轻触觉的神经元)中的选择性表达。图e. 磁刺激开始0、3和6秒之后,线虫的位置的变化。



图f,随着实验的进行,线虫对刺激产生适应性,对刺激产生反应的线虫的比例逐渐下降。


***

张生家的研究到此结束,全文完。

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