论文|青蛤MAPK/p38基因的克隆及Poly:Ic胁迫下的表达分析

青蛤是我国传统的经济养殖贝类，近年来，随着不断扩大的增养殖规模、日益加深的集约化程度以及不断恶化的养殖环境，青蛤的大规模病害和死亡现象日渐增多。

贝类属于非特异性免疫系统，其中Toll样受体是非特异性免疫反应中一类重要的识别受体，在对抗病原物的侵染过程中起着关键作用。MAPK家族是TLRs信号通路中的重要成员之一，它作为介导细胞反应的一种重要信号系统，参与了细胞间多种生化反应信号的识别、传递以及放大等处理过程。p38是MAPKs通路的主要蛋白之一，它的激活途径很保守，属于典型的3级激酶级联反应磷酸化激活途径。

克隆青蛤MAPK/p38基因，并分析其在Poly：Ic胁迫下的表达情况。探究MAPK/p38在MAPKs信号通路中的作用，为探索丝裂原活化蛋白激酶所参与的青蛤免疫机制提供重要的试验数据，并为选育贝类新品种、开发疫苗提供理论依据，减少其养殖过程中的大规模死亡现象，从而推动沿海地区的经济发展。

利用转录组测序获得青蛤MAPK/p38基因的序列信息，采用生物信息学软件分析该基因在近缘生物间的进化关系；利用巢式及荧光定量PCR技术克隆青蛤MAPK/p38基因的结构域序列，并在Poly：Ic胁迫后立即分析该基因在青蛤各组织中的表达情况以及血淋巴中的时序性表达情况。

克隆得到青蛤MAPK/p38基因的结构域序列，分析发现该基因在物种进化中很保守，其在青蛤的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃中均有表达，其中在血淋巴中表达量最高，腮中表达量最低。Poly：Ic胁迫3h后该基因的表达量达到最大值，与对照组差异极显著（P<0.01）。

◆青蛤MAPK/p38基因的生物信息学分析

分析显示MAPK/p38基因无跨膜区，为完整的胞内蛋白；其信息传递序列位于第30~40个氨基酸；有一个完整的激酶结构域：S-TKc，位于第27~311个氨基酸；建立系统发育树（图1），青蛤的MAPK/p38基因与光滑双脐螺的亲缘关系最近。

图1 青蛤MAPK/p38基因和其他物种的MAPK/p38基因氨基酸序列构建的系统树

◆青蛤MAPK/p38基因结构域的克隆

采用PCR技术扩增得到青蛤MAPK/p38基因的结构域序列（图2），结构域序列长855bp。扩增体系为25μL，其反应程序为95℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火1min，72℃延伸30s，40个循环。

图2 青蛤MAPK/p38基因结构域的克隆结果

◆青蛤MAPK/p38基因在不同组织间的表达

以β-actin基因在各组织中的表达量为内参对照，利用实时荧光定量PCR分析MAPK/p38基因在青蛤刚刚注射Poly：Ic后其血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃5个组织中的表达情况，结果表明该基因在以上组织中普遍表达（图3），但表达量有明显不同，在血淋巴中表达量最高，与其他组织相比差异极显著（P＜0.01），鳃中表达量最少。

图3 MAPK/p38基因在青蛤不同组织中的表达分布

◆Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的时序性表达

以β-actin基因为内参基因，用实时定量荧光PCR技术分析被Poly：Ic侵染后的青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中表达的时序性变化。结果表明：表达量达到最大值时为刺激3h后，与对照组相比存在极显著差异（P<0.01），之后的数值逐渐下降，最后趋于正常水平（图4）。

图4 Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的时序性表达结果

青蛤受到外界因素胁迫后，其血淋巴中MAPK/p38基因表达在较短时间内至最大值，说明病原物能够识别并诱导TLRs免疫受体及下游MAPK/p38信号通路蛋白，而后使其血液中合成相应的免疫信号蛋白，防止机体自身受到外来胁迫物的侵害。同时，MAPK/p38基因的表达量大体上呈现先升高后降低的趋势，证明MAPK/p38基因参与了非特异免疫的全部过程。该试验结果为探索丝裂原活化蛋白激酶所参与的青蛤免疫机制提供了重要的试验数据，并为选育贝类新品种、开发疫苗提供相应的理论依据。