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重磅!JNCI在线发表研究论文:circRNA翻译具有重要生物学功能的蛋白质

circRNA2019-02-10 16:09:27

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声 明




        2017年8月29日,中山大学附属第一医院神经外科张弩副教授团队在国际顶级学术期刊美国国家癌症研究所杂志JNCI(Journal of the National Cancer Institute,IF 2016=12.589)发表题为“Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis”的研究性论文,在国际上首次证实circRNA circ-FBXW7可以翻译一种抑制胶质瘤的全新蛋白质。circ-FBXW7翻译的蛋白FBXW7-185aa可以协同母基因编码的FBXW7蛋白调控原癌基因c-Myc蛋白的稳定性,抑制恶性胶质瘤的发生进展。此部分研究是在国际上首次报道circRNA翻译的蛋白质可以协同母基因翻译的蛋白质发挥生物学作用。本研究再次打破了科学界以往将circRNA看作“非编码RNA”的传统认识,进一步拓展了circRNA的研究领域。


        这也是2017年3月后 Cell research、Molecular Cell等杂志报道circRNA可以翻译蛋白质的又一篇在肿瘤学研究中的重量级的报道。山人认为该文相比之前的研究最大的突破在于发现circRNA可以翻译功能性蛋白并证明了产生的新蛋白的分子机制,新意突出,意义非凡!大家看到这篇文章的时候可能也会思考几个问题:作者怎样锁定本研究中的目标分子?怎么证实circRNA翻译蛋白质?如何研究circRNA翻译蛋白质的生物学机制?下面就让我们通过拜读这篇大作,一起学习下吧。


1. 如何锁定要研究的目标circRNA分子?

        首先作者通过对脑胶质瘤临床组织标本进行circRNA深度测序及生物信息学分析挖掘,发现了一些在脑组织以及癌旁组织中有明显表达差异的circRNA,研究者关注了著名的抑癌基因 FBXW7 基因的第 3、4 外显子环化后形成一个 620nt的环状 RNA,作者将此circRNA命名为circ-FBXW7。通过PCR、sanger测序、northern blot、FISH等常规实验技术手段证实了circ-FBXW7在组织中的表达情况及大小和亚细胞定位。作者发现circ-FBXW7真实的大小长度是620nt,而不是circbase数据库中提交报道的1227nt。山人抱着惊讶的心态去cicbase数据库中去检索了一下,发现目前circbase数据库中还是收录的序列长度为1227nt,这是什么原因呢?按照本研究的报道发现circ-FBXW7 跨越的基因组长度是1227bp,但是中间有一段不保守的内含子被剪接掉了,山人回想起来之前来自北京生科所的赵方庆研究员报道的发现circRNA内部存在可变剪接,是不是这个原因导致的circbase收录的序列长度有错误呢?山人又到来自南京航空航天大学宋晓峰教授构建的circRNADb在线数据库检索了一下,发现此数据库收录了FBXW7基因对应的一个circRNA跨越基因组长度1227bp的分子,剪接的成熟体circRNA是620nt,和本研究报道的吻合。 通过这一细节,山人发现作者研究团队前期研究做的非常严格,没有盲目相信circbase中提交的序列,而是通过了自己的实验确定了circRNA circ-FBXW7成熟体真实长度,可见好的开始是成功的一半。这也给广大circRNA研究者提供的一个思路,一定要用严格的实验证实目标分子大小。

图1,2 circRNA高通量测序以及 circ-FBXW7 识别鉴定(来自参考[1])

 

2 怎么证实circRNA翻译蛋白质?

        作者进一步研究发现在circ-FBXW7中存在高度保守的内部核糖体插入位点序列(IRES),并用双荧光素酶系统证明了其活性。IRES后存在一个跨越环状接点的开放读码框(编码185个氨基酸)。作者通过构建circRNA系列表达载体以及制备特异性检测circRNA翻译蛋白的抗体并且结合质谱检测的手段,证实了circ-FBXW7 RNA 翻译了一个大约21KD的蛋白质,将其命名为FBXW7-185aa。circ-FBXW7环化后形成的开放阅读框跨越环化位点多翻译18个氨基酸,这18个氨基酸是在目前的已知蛋白质数据库中没有收录的,因此作者针对此18个氨基酸制备特异性抗体。回忆起之前发表在cell research和Molecular Cell的论文均没有抗体检测内源性circRNA翻译蛋白的直接证据,相比之下,本文以抗体和质谱证实了内源性蛋白的客观存在,也是一大亮点!

图3 circ-FBXW7翻译蛋白质(来自参考[1])

 

3 证明circRNA翻译蛋白质有生物学功能

        故事到此已经很明朗了,作者发现circRNA circ-FBXW7在胶质瘤中表达降低,而且翻译了一个蛋白质,那么自然就想到了circRNA翻译的蛋白质有没有生物学功能。通过常规的细胞功能学实验作者发现circ-FBXW7翻译的蛋白质可以很明显抑制肿瘤细胞的增殖。本章节作者使用环状过表达RNA载体,设置了一个严谨的对照组:把IRES序列突变掉,原因是IRES序列突变后,circRNA可以形成但是翻译蛋白质就受到很大影响,证实是蛋白质发挥了作用,而不是RNA。山人此刻也回忆起来教科书上写的“蛋白质往往是生命活动的最终体现者”,可见教科书上的东西还是经得起验证的!

图4 circ-FBXW7翻译蛋白质可以抑制脑肿瘤增殖(来自参考[1])

 

4 circRNA翻译蛋白质作用分子机制

        本章节是研究的又一个大的亮点部分,如果只发现一个circRNA翻译了蛋白质,有生物学功能等很难发表在顶级期刊上。作者后续进一步证实了FBXW7-185aa协同母基因FBXW7产生的蛋白一起调控原癌基因c-Myc的稳定性。故事到底是怎么样的呢?研究报道FBXW7基因作为一个E3泛素连接酶,可以通过泛素化途径调控一大批癌基因的稳定性,其中就包括了著名的原癌基因c-Myc。作者首先证明circRNA翻译的小蛋白FBXW7-185aa 也能明显降低c-Myc蛋白的表达,并证明FBXW7-185aa影响c-Myc的半衰期。到此作者想到circRNA翻译的小蛋白是不是和大蛋白作用上有关联,可能通过查阅文献,发现了一个重大线索:去泛素化酶USP28是可以提高c-Myc蛋白质稳定性。FBXW7a降低c-Myc蛋白质稳定性,USP28结合FBXW7a N端序列从而抑制FBXW7a对c-Myc的降解。作者推测是否FBXW7-185aa蛋白也可以结合USP28从而促进c-Myc蛋白的降解呢?通过IP及pulldown实验证实,circRNA circ-FBXW7翻译的小蛋白质可以竞争性的结合USP28,从而促进全长蛋白FBXW7a对c-Myc蛋白的泛素化降解。难道细胞也懂得“打仗亲兄弟,上阵父子兵”道理? 

图5 circ-FBXW7翻译蛋白质的作用分子机制(来自参考[1])

 

5 circRNA翻译蛋白质临床意义及动物实验

        基于上述的研究发现,研究者最后又对临床脑胶质瘤标本进行检测,统计临床关联性。做了胶质瘤细胞的小鼠脑部原位成瘤实验,结论就是:人类细胞中circRNA circ-FBXW7可以翻译一个新的蛋白,对胶质瘤有抑制作用并与胶质瘤患者的临床预后有关联性。

图6 环状circ-FBXW7翻译蛋白质临床意义及动物实验(来自参考[1])


6 关于本文为什么可以发表在JNCI杂志上的几点思考: 

 (1)作者在第一步选择分子的时候就做了严格验证,通过严谨的实验证实了客观存在的circRNA的成熟体序列。另外山人认为作者选择的分子非常漂亮,根据数据库及测序信息选择了一个表达丰度非常高的分子做研究对象,而且母本基因是一个非常明星的分子-FBXW7。


(2)课题新颖性足够大。本来能证明circRNA翻译蛋白质已经比较新颖,作者又拿出以往研究没有的证据,证明内源性circRNA翻译蛋白质的存在;另外分子机制明确,将原癌基因c-Myc作为切入点也是本研究的一大亮点。


        最后,本文毫无疑问将是2017年度circRNA在肿瘤研究领域的重大进展之一。本研究也是山人看到的第一个circRNA翻译的蛋白质在肿瘤学领域有重大意义的报道。circRNA不是像往常认为的那样不能翻译蛋白质,而是可以翻译有重要生物学功能的蛋白质!山人期待未来有更多更有趣的circRNA相关研究工作发表出来。


参考文献:

1. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis 

Yibing Yang Xinya Gao Maolei Zhang Sheng Yan Chengjun Sun Feizhe XiaoNunu Huang Xuesong Yang Kun Zhao Huangkai Zhou ... Show more

JNCI: Journal of the National Cancer Institute, Volume 110, Issue 3, 1 March 2018, djx166, 

https://doi.org/10.1093/jnci/djx166

Published:29 August 2017

 



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